磺化NHS-生物素

产品货号：

GS4320

中文名称：

磺化NHS-生物素

英文名称：

Sulfo-NHS-Biotin

产品规格：

50mg

发货周期：

1～3天

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磺化NHS-生物素(Sulfo-NHS-Biotin)能够简单有效地标记抗体，蛋白质和其他含伯胺的分子。同时，对细胞表面的蛋白进行特异性标记也是这种水溶性和膜不可渗透试剂的常见应用。

生物素是一种以高亲和力结合抗生物素蛋白和链霉亲和素蛋白的维生素。因为它的分子量很小(244 Da)，所有生物素可以与很多蛋白结合而不影响它们的生物活性。标记的蛋白质可以使用固定的链霉亲和素和抗生物素蛋白从未标记的蛋白质中纯化，并且可以用链霉亲和素或亲和素缀合的探针在ELISA，Dot blot或Western blot应用中检测。

NHS活化的生物素与pH7～9缓冲液中的伯氨基(-NH2)能够有效反应，形成稳定的酰胺键。包括抗体在内的蛋白质，通常在赖氨酸(K)残基的侧链中具有几个伯胺，并且每条多肽的N末端可以作为NHS活化的生物素试剂进行标记的靶标。

生物素几种不同的NHS酯具有不同的性质和间隔臂长度，都可以使用。Sulfo-NHS-Biotin是水溶性的，使其能够在没有有机溶剂如DMSO或DMF的情况下进行反应。细胞表面生物素化已经成为研究受体和转运蛋白的表达和调节，局限于细胞器膜的蛋白质的质膜分化以及膜蛋白在极化上皮细胞中的分布的重要工具。这些应用已经证明了Sulfo-NHS-Biotin对细胞表面标记的特异性。因为Sulfo-NHS-Biotin易在极性溶液中溶解，并且通过亚砜基团在琥珀酰亚胺基环上加成，因此不能渗透细胞膜。只要细胞保持完整，因此只有暴露于表面的伯胺才能被生物素化

分子量	443.43
间隔臂	13.5 Å
纯度	＞95%(TLC)
结构式

组分	规格
磺化NHS-生物素	50mg
说明书	1份

保存：-20℃，避光

注意事项

Sulfo-NHS-Biotin对湿度敏感，将其放在-20℃下干燥储存。为了避免产品中的水分冷凝，开瓶前必须先平衡至室温。
按照说明书方法，试剂在使用前溶解。NHS-酯部分易水解并变成无活性，因此不要制备用于储存的储备溶液，实验前配制，弃掉所有未使用，重构的试剂溶液。
避免使用含有胺(如Tris和甘氨酸)的缓冲液，因为胺对反应有竞争性，如有必要，透析或用其他脱盐方式，将蛋白质样品的缓冲液交换为无胺体系，如磷酸盐缓冲液。
在溶液中生物素化蛋白质时，过量未反应的生物素和反应副产物可以很简单的通过脱盐柱或透析去除。1～10mg约0.5～2mL的蛋白质适合用10mL脱盐柱。对于较小质量的蛋白或反应体积，生物素反应和后续的缓冲液交换都可以在单个MiNi透析单元中进行。若需要处理大体积反应物，则将样品分成两个脱盐柱处理或使用合适的Slide-A-Lyzer透析盒。对微量体积(即10～150μL)的肽和其它小分子量的蛋白分子，可以用Pierce C-18自旋柱处理。

一、溶液中生物素化蛋白质的方法

计算生物素制剂用量
生物素标记的掺入程度取决于氨基在蛋白质上的分布情况，蛋白质的浓度和使用的试剂量。与浓缩蛋白质溶液相比，用稀释的蛋白质溶液进行标记，反应需要更大倍数摩尔比的生物素试剂才能达到相同的掺入水平。进行实验时，使用20倍摩尔过量的生物素试剂来标记1～10mg抗体(0.5～2mL)，可以在每个抗体分子中产生4～6个生物素基团。若使用50倍摩尔过量的生物素试剂来标记50～200μg抗体(200～700μL)，只能在每个抗体分子中产生1～3个生物素基团。调整Sulfo-NHS-Biotin与蛋白质的摩尔比，来获得实验所需的掺入水平。
生物素标记反应
- 从冷冻室里取出Sulfo-NHS-LC-生物素，在步骤3打开之前将其平衡至室温。
- 按照A部分的计算制备蛋白质溶液，用PBS溶解。
  - 已经溶解在pH7.2～8.0的无胺缓冲液中的蛋白质可以不用进行缓冲液交换或用PBS稀释，直接使用。若溶于Tris或其他含胺缓冲液中的蛋白质，必须交换到合适的缓冲液中才能使用。
- 使用前立即制备10mM生物素试剂溶液：2.2mg Sulfo-NHS-Biotin加入500μL超纯水。
- 加入适量(见A部分计算)10mM生物素试剂溶液到蛋白溶液中。
- 冰上孵育2小时或室温孵育30分钟。
  - 除了一般蛋白质的降解或微生物生长的可能性外，反应时间长于指定时间没有任何损害。
- 此时蛋白质标记完成，虽然过量的未反应物质和水解的生物素试剂残留在溶液中，但通常可以通过ELISA或Western印迹进行标记蛋白的初步测试。一旦确定蛋白质的功能正常和标记成功，为了获得蛋白质最佳的性能和稳定性，可以使用脱盐柱或透析来纯化标记的蛋白质。如果用生物素定量试剂盒来确定生物素掺入的水平，蛋白质必须先经过脱盐或透析除去未反应的生物素。

二、细胞表面蛋白生物素化的方法
文献中提到这种方法存在许多变化。标记可以在细胞悬浮液上或在培养板中的贴壁细胞上进行。在后者情况下，Sulfo-NHS-Biotin向细胞的所有表面扩散会受到限制，并且标记将主要发生在暴露的细胞表面上。另外必须将细胞中的培养基成分洗涤干净，否则其中的含胺组分会与细胞表面蛋白竞争并淬灭反应。使用浓缩的细胞悬浮液是最有效的，因为反应中只需要较少的生物素试剂。通常，终浓度为2～5mM生物素试剂是有效的。NHS的反应速度随pH的增加而增加，因此，下述实例中pH= 8.0，使其能尽快地完成标记。

用预冷的PBS(pH8.0)洗涤细胞三次，从细胞中除去含胺的培养基和蛋白质
在PBS(pH8.0)中，以约25×10⁶个细胞/ml的浓度悬浮细胞。
每毫升细胞悬浮液加入1.0mg Sulfo-NHS-Biotin试剂(约2mM生物素试剂)。或者每毫升细胞悬浮液中加入200μL 10mM生物素试剂溶液(见上一步B.3)。
反应混合物在室温下孵育30分钟。
注：在4℃下进行孵育可能会降低生物素试剂的活性内化。
用Wash Buffer(PBS，100mM甘氨酸)洗涤细胞三次，淬灭并除去多余的生物素试剂和副产物。

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